細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離

一、原理

   細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來。
    分離細(xì)胞器zui常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。
    勻漿（Homogenization）低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)（即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣）進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。
    分級(jí)分離（Fractionation）由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的*次沈淀必然不是純的zui重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。
    分析  分級(jí)分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。
    二、細(xì)胞核的分離提取
    （一）操作步驟
    1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊（去除結(jié)締組織）盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。
    2．將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。
    3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。
    4．將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500rpm，離心15分鐘；（1）緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；（2）同時(shí)涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥；（3）余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。
    5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。
    6．將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。
    （二）結(jié)果
    分別于高倍鏡下觀察三張涂片，描述鏡下所見。
    三、高速離心分離提取線粒體
    （一）操作步驟
    1．將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。
    2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液混勻成懸液（可用牙簽）。
    3．取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上（分別標(biāo)記④、⑤涂片），各滴一滴0.02％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。
    （二）結(jié)果
    油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。