恒遠生物|免疫熒光技術的基本原理

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展zui早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。





該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。

主要缺點是：非特異性染色問題尚未完quan解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。




一、原理




免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。




直接法：將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。




間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發生反應，因此，制備標記抗體適用于雞任何抗原的診斷。




二、技術分類：




1.熒光抗體技術（熒光顯微鏡技術）




抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。




2.免疫熒光測定技術：




抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法。




1）熒光物質




熒光色素




許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。




常用的熒光色素：




（1）異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長為490495nm，zui大發射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都geng好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用zui廣泛的熒光素。




其主要優點是：




①人眼對黃綠色較為敏感




②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。




（2）四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙-酮。性質穩定，可長期保存。zui大吸收光波長為570nm，zui大發射光波長為595-600nm，呈橘紅色熒光。




（3）四甲基異硫氰酸羅丹明，zui大吸引光波長為550nm，zui大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。




常見熒光素的特性：




1）FITC：黃色結晶粉末，吸收光：490～495nm，發射光：520～530nm，明亮的黃綠色熒光。




2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發射光 595～600nm，橘紅色熒光。




3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發射光 620nm，橙紅色熒光。




4）鑭系：Eu3+、Tb3+




5）PE：吸收光490～560nm，發射光 595nm，紅色熒光。




6）其它：酶作用后產生熒光物質。