恒遠生物干貨:酶切切不動,裝不上,該咋辦?

   DNA中加上酶，然后保溫一段時間就可以了。但是在實際操作過程中，我們不斷聽到：切不動，裝不上。問題在什么地方?對此，您可以懷疑酶的質量問題，但是更多的問題來源于模板是否合適酶切要求。今天上海恒遠生物將為您帶來點干貨：酶切切不動,裝不上,該咋辦?
1.成功酶切的關鍵是準備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機溶劑(會使酶變性或產生星號貨性)，不能含有干擾酶活性的污染物質，不能含有高濃度的 EDTA (TE中的EDTA濃度較低，對Mg的濃度影響較小)；同時要對DNA甲基化程度及其對酶切效率的影響要做到心中有數。
2.選用合適的酶。根據酶切序列選用，特別注意選用甲基化對酶活性的干擾。
3.正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來。運輸和臨時存放時需要將酶至于冰上。手拿酶管時不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時盡可能用長tip, 避免污染。用完后需要及時送回原處。注意：酶通常是zui后加。
4.反應體積需要根據實驗目的定，常規的酶切一般要維持在10-50ul，酶切鑒定10-20ul就可以了。
5.模板濃度問題：濃度過高，溶液黏度過大，酶不能有效擴散，酶切效果不會好。濃度過低，也會影響酶活性。
6.注意模板用量和反應體積的關系。對酶用量，模板用量，反應體積等要素的確定需要的是時間和經驗的積累。
7.酶切反應的各個組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次，short spin 一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。
8.反應溫度的選擇。一般反應都用37度，但是 Sma I 的溫度是25度，37度時酶仍表現出活性，但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應，如taq I的zui適溫度為65度，37度保溫，效率僅為前者的1/10。
9.反應時間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要*酶切可以采用少量的酶長時間反應，或較高的酶量短時間處理都可以達到。在使用高酶量的時候需要注意甘油的zui終濃度不要超過5%，也就是說10ul的體系，酶的用量不要超過1ul。
10.是否和如何終止反應?酶切鑒定之類的實驗不需要特殊處理。滅活的手段：加入高濃度的EDTA;65度或80度熱處理20-30分鐘;部分從高溫菌純化出來的內切酶由于zui適的反應溫度比較高，熱處理滅活不一定*，需要用苯酚/氯fang/yi醇方法純化;電泳回收也是實驗室常用除酶的手段。

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